1表面增強拉曼的原理

1.1SERS閃爍和擺動

有文獻報道在單顆粒和納米聚集體上發現了不連續表面增強拉曼散射現象。典型的閃爍時間間隔從毫秒到秒不等。最近的研究發現SERS閃爍包括了熱激活和光誘導兩個部分。許多證據顯示這種SERS信號的波動是由于熱激活分子在顆粒表面的擴散而產生的。利用波長分辨光譜進而發現信號波動來自增強拉曼散射，而不是光致發光或者瑞利散射。測量的信號強度包含了拉曼和背景信號在557–663nm的波段的總和。另一個重要的特征是SERS光譜包含了很強的背景信號。這種背景信號并不是R6G的熒光而是SERS的連續發射信號。在SERS閃爍的“Off”階段，光數量很少，這說明SERS信號和背景信號是成正相關的，而且是同時波動的。Michaels等發現SERS強度和背景信號隨時間成高度相關。大量的數據統計發現在0.1mW激光激發下，SERS閃爍的On-time大約是80ms。另一個有趣的發現是SERS光譜擺動現象，就是SERS信號會突然改變他們的頻率。這種現象首先由Nie和Emory報道。他們發現拉曼信號的頻率變化可以有10cm-1的改變。SERS光譜波動的另一個來源是含碳基團和其他光解化合物。實驗過程中需要把單分子SERS信號與污染分子的信號區分開來。有研究發現環境中的氧氣在SERS閃爍中扮演了重要的角色。在含氧環境中SERS閃爍的頻率很快，波動的幅度更大。其它的理論和實驗則認為SERS閃爍來自于顆粒本身而不是吸附分子的擴散，因為在無吸附物的條件下如銀粉和氣相沉積銀膜，同樣觀察到了閃爍現象。

1.2SERS活性位點

一個關鍵問題是關于顆粒表面的活性位點的結構和性質。之前的研究發現SERS活性位點很可能是吸附原子、原子簇和顆粒尖端。這些位置可以通過共振電荷轉移和類似共振拉曼增強方式進行化學增強。換句話說，吸附分子和活性位點之間的耦合可以產生新的金屬配體或者配體金屬之間的電荷轉移，這種狀態可以用可見光激發。Hildebrandt等認為SERS活性位點是高親和性結合位點。為了進一步研究這些SERS活性位點，Doering等使用了一種整合流動注射和光譜裝置來研究吸附分子被其他分子置換現象。在加入鹵化物之前，SERS光譜經常包含很寬的背景和檸檬酸根的微弱信號，但是沒有R6G的信號。在加入鹵化物之后，他們發現R6G的SERS光譜很快替換了檸檬酸根的光譜，R6G的信號在10-30min中不斷增加。這種置換行為是連續的，最終SERS光譜被一種或吸附在活性位點的少量分子信號主導。這些結果也進一步說明，這些SERS活性位點最開始是沒有活性的或者被檸檬酸根離子所占據。鹵離子在顆粒表面的吸附可以幫助R6G在顆粒表面的吸附，并且阻礙檸檬酸根離子在活性位點的吸附。

1.3化學激活和失活

研究SERS機制時面臨的一個重要困難是將化學增強因素從電磁效應中分離出來。為了解決這一問題，Doering等使用了整合流動注射和超靈敏光學成像系統直接研究化學增強。他們的實驗系統中膠體銀顆粒被固定在微流動裝置的玻璃表面，在固定顆粒表面加入化學試劑就可以實時觀察到單顆粒SERS信號。這種單顆粒原位表面等離子體散射研究發現在經過化學處理后，單顆粒的電磁性質并未改變。因此觀察到的SERS光譜變化應該主要來自于化學增強。他們的實驗數據表明3種鹵粒子(Cl、Br和I)有顯著的SERS激活效應，而其他離子，如檸檬酸根、硫酸根和氟化物則對單顆粒SERS信號幾乎無影響。然而，他們發現硫代硫酸根離子則會使SERS信號完全消失。在對顆粒處理鹵粒子和硫代硫酸根處理25min后，未產生任何表面等離子體散射的變化。因為表面等離子體散射可以用于測量單個和多個顆粒的電磁場性質，因而他們認為這種觀察到的激活/失活效應主要來自于顆粒表面的原子尺度的改變，而不是大尺度的顆粒電磁場性質改變。進一步的波長分辨實驗表明，單顆粒等離子體散射可以引起散射光譜小的改變，但是這種小的位移不太可能引起電磁增強發生大的變化。事實上，之前的研究顯示表面等離子體光譜通常很寬，而單分子SERS與表面等離子體散射并不直接相關。

1.4單顆粒和多顆粒的SERS比較

為了比較單個顆粒和小聚集體之間的SERS活性，Khan等核實了SERS活性位點是否跟表面缺陷或者顆粒間隙有相關性。不過結果顯示，高SERS活性跟表面性質沒有顯著相關性。另外，他們也發現有些固定的單顆粒與Dimers和Trimers的平均SERS強度相似，但這些信號強度比那些大聚集體的信號低3-4倍。但是單顆粒的SERS信號重復性更好，而且具有更窄的光閃爍時間間隔。盡管理論預測單個納米顆粒周圍的電磁場強度沒有兩個顆粒之間的Nano-gap的強，但每個顆粒可以吸附大量的分子。當單個顆粒表面吸附了單層拉曼分子時，其SERS信號就達到最大值。當分子定位在兩個靠近的納米金納米縫隙中時，可以使SERS信號得到極大增強。然而，事實上，很難制造出這種Dimer或Trimer，可以讓分析物非常精確地定位在Nano-gap里。并且，金屬納米顆粒是被周圍的電子云包圍，他們可以通過靜電排斥阻止其他顆粒靠近。這種靜電排斥可以被強電解質減弱，但這樣經常會引起不可控的顆粒聚集和沉淀。一個可行的辦法是加入高分子或表面活性劑提供空間位阻，因而阻止納米金的直接接觸。Chen等制備了Au@Ag的Dimer和Trimer結構，他們發現dimer的SERS效果是單顆粒的16倍，而trimer是單顆粒的87倍。Lee近一步研究了Dimer之間的距離跟SERS效應的關系，發現當Dimer之間的gap達到1nm以下時，增強因子可以達到1013。

2表面增強拉曼探針的制備

納米技術的發展給SERS技術的發展帶來了新的活力。第一代SERS探針是由Porter等制備，他們使用拉曼分子和定位配體在金屬納米顆粒上共吸附的方式。然而，這種方式的一個很大局限性就是這些納米探針由于沒有跟外界的環境隔絕，容易發生光譜變化和膠體聚集。為了解決這個問題，許多實驗室使用了各種各樣的包裹策略。聚二乙烯基包裹的SERS探針可以很好的保護探針，但對于生物偶聯需要二次修飾，并且這種微米級的尺寸不太適合做細胞內的分子檢測。二氧化硅修飾的探針是在納米級的，也適合生物分子共組裝。這種核-殼結構的SERS探針包含了3種關鍵組分：金屬核心用于光學增強，報告分子用于光譜分析，二氧化硅殼用于保護和生物偶聯。這種設計成為SERS探針生物分析應用的基礎模式，并可免受外界環境的干擾。完整的二氧化硅包裹可以增強SERS探針在高電解質下的穩定性。但是一個缺點就是這種二氧化硅包裹的顆粒容易非特異吸附蛋白和細胞表面。二氧化硅包裹技術需要拉曼分子帶有巰基或者異硫氰酸酯用于表面吸附。Qian等設計了一種新的SERS探針可以解決以上面臨的問題。PEG修飾的SERS探針由3個組分組成：60nm的檸檬酸保護的納米金，拉曼分子和PEG-SH(5000MW)（圖5）。UV-Vis吸收，TEM，DSL測量顯示在納米金溶液中加入MGITC后沒有明顯的聚集。加入少量的MGITC沒有改變納米金在533nm的等離子體共振峰，但假如SH-PEG后有1nm的紅移。PEG-SH保護的納米金顆粒具有很小的非特異性吸附和可忽略的細胞毒性。另外，使用不同修飾的PEG可以偶聯多種生物配體分子。PEG-SH修飾納米金顆粒可以使用非巰基拉曼分子結合在納米金上，同時卻可以阻止溶液里的其他分子接近納米金表面。與二氧化硅包裹不同的是。PEG-SH包裹并不會將吸附的非巰基拉曼分子置換掉。根據對多種拉曼分子如CrystalViolet、NileBlue、BasicFuchsin和CrysylViolet關于Perchlorate的研究顯示，這些非巰基的染料跟PEG-SH可以很好的兼容。事實上，使用CrystalViolet的SERS探針可以穩定超過11個月。研究中使用的染料都是帶正電荷的，并包含多個π鍵。這說明很多種類的有機分子可以作為拉曼分子用于PEG-SH包裹的SERS探針。為了將SERS探針用于多元檢測和成像，需要篩選出不同的拉曼分子，由于拉曼分子拉曼峰有時會重疊，對多元檢測造成困難。Wang合成了一種有機物-納米金-量子點的復合納米SERS探針，這種探針可以進行SERS和熒光的雙重生物標記，進而可以用于生物標記物的生物條形碼分析，增強了多元檢測能力。

3表面增強拉曼在生物分析中的應用

在過去的十幾年中，研究者在SERS用于超靈敏檢測生物分子方面投入了極大的興趣，如血紅蛋白、葡萄糖、腫瘤基因、病原體、生物毒素和病毒檢測。SERS是一種近場探針，對周圍的環境很敏感。幾個研究小組的成果表明如果在金屬納米顆粒或者核殼結構的顆粒表面修飾上pH敏感的SERS探針分子，SERS可以作為一種pH納米探針用于細胞內或者細胞外檢測。總體來說，在SERS應用方面現在有兩種類型的工作：第一種類型是使用單分子SERS用于單一分析物如DNA堿基對和單個血紅蛋白的指紋圖譜分析，這里，待分析分子被放置在單個顆粒的Hotspot位置或者是納米顆粒的聚集處；第二種類型是從納米顆粒表面覆蓋的單層分子上獲得的SERS圖譜，這種圖譜可以得到明確頻率和帶寬的宏觀數據。如果膠體納米粒子和分析物不受外界環境的影響，那么得到的SERS圖譜強度和重復性都是可控的。這種設計在復雜的細胞樣品或者全血分析中有強大的優勢。

3.1生物標記物檢測

Jin等以多種拉曼分子修飾的納米金為SERS探針設計了一種多元SERS檢測平臺。每種SERS探針對應一種DNA檢測分子，并使用銀沉積增強SERS信號，實現了多種DNA分子的同時檢測。Kang等設計了一種Particle-on-wire的SERS傳感器用于DNA的多元檢測。在納米線與納米顆粒之間形成的Nanogaps里Hotspots可以顯著增強SERS活性，實現了多種病毒DNA分子的檢測。Souza等最近的工作使用了SERS探針實現了細胞內特定生物分子的定位檢測。他們使用Au-噬菌體-咪唑復合物用于標記溶液里的細胞。但是噬菌體本身有很高的SERS背景信號，降低了實驗的信噪比，而且探針光譜容易發生變化。Huang等證明了抗體標記的金納米棒作為癌細胞診斷探針，這種探針使用CTAB作為SERS的拉曼分子。他們將金納米棒修飾上聚苯乙烯磺酸鈉來穩定溶膠體系，將納米棒的表面電荷從負電荷變成正電荷。Hu等將氰基團偶聯在拉曼分子上以此來區分其他分子的振動峰。Yu等將納米銀結合上熒光染料，可實現細胞和組織的SERS和熒光的雙重成像。

3.2單細胞分子成像

偶聯生物分子的SERS納米探針已經用于識別腫瘤細胞上的蛋白標記物。對腫瘤細胞檢測來說，可使用SH-PEG（~85%）和SH-PEG-COOH（~15%）的混合物來制備可定位納米金顆粒。雙修飾的PEG可以共價結合ScFv抗體上，ScFv抗體可以與表皮生長因子特異性結合。人頭部和頸部腫瘤細胞(Tu686)都是EGFR陽性的（每個細胞有個受體），可以用SERS方法檢測到。相反，人非小細胞肺癌則不表達EGF受體，不能顯示出SERS信號。人們使用一種近紅外染料(DTTC)用作光譜探針用于785nm的表面增強共振拉曼。這種共振增強不會引起光漂白，因為這種吸附染料將有效能量轉移到金屬顆粒而免于光降解。這種共振效應可進一步將SERS效果提高10–100倍。這種靈敏度足夠用于單個癌細胞的拉曼分析。EGFR是EGF抗體的特異靶標，也是蛋白激酶療法的重要蛋白，因此單細胞SERS分析檢測EGFR對臨床診斷有重要意義。

3.3體內腫瘤定位和檢測

為了確定在動物組織中能否從PEG修飾的納米金顆粒上得到SERS圖譜，Qian等在活體動物皮下組織和深層肌肉組織注入小量的SERS探針。結果表明可以同時在皮下組織和深層肌肉組織得到高度可辯SERS信號。盡管由體內得到的信號強度減少了1-2個數量級，但得到的SERS圖譜與體外的圖譜一致。由于實驗的信噪比很高，可以估算對于體內SERS腫瘤檢測可以探測的深度是1-2cm。為了實現體內腫瘤定位和成像，偶聯了ScFv抗體的納米金顆粒通過尾靜脈注射進入腫瘤小鼠體內。使用785nm的激光照射了腫瘤和非腫瘤部位。可以看出在腫瘤部位可定位SERS探針與非可定位SERS探針的SERS圖譜有明顯的差距，然而對于非腫瘤區的SERS信號則很相似。結果說明了ScFv抗體偶聯的納米金顆粒可以定位EGFR陽性的腫瘤組織中。時間分辨的SERS數據近一步表明了SERS探針在進入小鼠體內4-6h是逐漸積累的，并且大多數的探針保留在腫瘤組織超過了24h。在生物體系研究方面，SERS可以直接用于分析水相生物分子的結構狀態研究且所需樣品用量少。將SERS技術用于生物研究的先驅是Koglin、Nabiev和Cotton等。此后，大量的研究工作證實了這一技術能夠解決生物化學，生物物理和分子生物學中的很多問題，如蛋白質，核酸及其組分等的分析與鑒別，生物分子的某些基團與界面的相互作用研究，生物分子與金屬表面的鍵合方式等。

4結束語

本文討論了SERS的基本原理和增強機制，重點介紹了基于SERS的生物醫學應用，并探討了SERS的細胞成像、活體成像等領域的研究進展。SERS成像作為一種快捷、高效、無損、高靈敏度的檢測手段，在生物醫學、藥物、食品檢測等領域展現了巨大的應用潛力，特別是在生物醫學領域的細胞成像、腫瘤識別等方面的研究更具有重要價值。同時，SERS成像也面臨一些問題，如每個像元的積分時間過長、SERS探針的制備困難等等。目前開展的工作仍處于臨床前研究階段，要實現SERS成像技術在腫瘤疾病臨床診斷上的實際應用還需要各個不同學科領域的研究者加強溝通與合作。

作者：王東方 宋世平 單位：中國科學院上海應用物理研究所 中國科學院大學